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固相合成技術因其操作簡便、易于實現自動化，已成為合成小核酸和多肽藥物的常用方法之一。近年來，微波輔助合成和流動合成技術的引入進一步提升了固相合成的合成效率和產量。然而，這些技術通常依賴昂貴且高度專業(yè)化的儀器，限制了其在常規(guī)實驗室中的普及。此外，目前在Fmoc固相合成中廣泛使用的活化試劑HATU，存在熱穩(wěn)定性差和安全隱患。
鑒于此，瑞士日內瓦大學Nicolas Winssinger團隊利用通用的液相分析系統(tǒng)，通過將其改造用于流動化學技術，實現高效液相色譜儀（HPLC）到多肽合成儀的轉變。
HPLC是常用的分離分析技術，樣品經色譜柱分離組分，實現樣品的純度檢測。該團隊創(chuàng)新的在色譜柱前的保護柱中填充10mg樹脂作為微型流動反應器，內置2 μm熔塊，以防止樹脂流失，同時借助DAD檢測器（檢測Fmoc脫保護副產物）實時反饋合成結果。
該方案采用TBEC（1-叔丁基-3-乙基碳二亞胺）/Oxyma（2-肟氰乙酸乙酯）作為活化體系，無需額外加堿和預活化步驟，不僅簡化了流程，還更加的安全和環(huán)保。
在上述設備和活化體系基礎上，為探索合成條件，以苯丙氨酸五聚體為模型，在改造的HPLC系統(tǒng)上進行優(yōu)化條件。實驗結果表明，經優(yōu)化后的條件可成功合成目標五肽，且實現粗品純度＞93%單步純度＞99%。
具體方法如下：
整個合成流程包括如下幾個階段：
1. 稱重及負載樹脂：稱取10 mg樹脂（如Rink Amide樹脂）填入空保護柱中，密封固定；
2. 樹脂溶脹：將負載樹脂的保護柱浸入二氯甲烷中，溶脹3-5分鐘；
3. 安裝：設置柱溫箱溫度為80℃，并將保護柱安裝至對應支架中；
4. 試劑溶液配備：
樣品溶液：配置0.6 M Fmoc氨基酸、TBEC和Oxyma的NMP溶液，并等體積混合得到0.2M溶液；
脫保護溶液：在DMF中加入20%體積的哌啶，轉入自動進樣器小瓶中備用；
5. 編寫注射序列程序：設置儀器交替注射，活化的氨基酸衍生物溶液（用于偶聯）和20%哌啶的DMF溶液（用于脫保護）；另外，在合成開始前，需連續(xù)進行兩次脫保護，以確保初始Fmoc基團完全去除。
6. 樹脂裂解和脫保護：將保護柱浸入二氯甲烷中去除殘余DMF；然后取出樹脂，浸沒在TFA溶液中（TFA/三異丙基硅烷TIS/H2O=95:2.5:2.5），反應3小時，以達到完全解離和脫保護。對于含半胱氨酸，甲硫氨酸等的特殊序列，可使用TFA/1,2-乙二硫醇EDT / TIS / H2O=90 : 5 : 2.5 : 2.5混合裂解液。
7. 產物處理：分離樹脂，使多肽粗品析出，進一步純化。
對于組氨酸等易消旋的氨基酸及部分特殊氨基酸而言，預活化時間對其偶聯效率具有顯著影響：該團隊在合成20肽時，比較了新制活性酯和預活化24小時后打的偶聯效率，發(fā)現Fmoc-Arg(pbf)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH在長時間活化后偶聯效率比較低。
為進一步研究預活化時間對偶聯效率的影響，以Fmoc-Arg(pbf)-OH為原料分別在預活化15分鐘和24小時后合成FRF三肽。結果顯示，預活化24小時后，偶聯效率顯著降低，歸其原因是Fmoc-Arg(pbf)-OH在活化后，會經歷分子內環(huán)化，降低其反應性。經反復試驗驗證，理想的活化溶液應在制備4小時內使用。
肽合成過程中的異構化可能會影響立體化學純度并改變生物活性。為評估在該合成條件下的消旋化程度，該團隊采用液相合成方法，對脯氨酸、半胱氨酸和絲氨酸等易消旋的氨基酸進行考察，均未發(fā)現消旋化現象。進一步比較TBEC/Oxyma體系和HATU/DIPEA體系的偶聯效果，團隊采用新鮮活化的His(Trt)進行反應，實驗發(fā)現前者差向異構化為3.6%，而后者異構化比例為4.8%。
該團隊成功合成了GLP-1（30氨基酸）和比伐盧定（20氨基酸）等多肽，其中使用含10 mg樹脂的合成柱合成GLP-1的收率為52.1%。而在生物活性方面，用HPLC合成的比伐盧定粗品和通過常規(guī)SPPS合成的比伐盧定純品具有相似的生物活性（見下圖）。
現成的HPLC應用于自動化流體合成多肽，具有以下優(yōu)勢和不足之處：
1. 優(yōu)勢：
將標準HPLC轉變?yōu)槎喙δ芎铣善脚_；
采用更安全的TBEC/Oxyma活化體系；
可獲得高純度多肽，同時能夠實時監(jiān)控反應；
立體選擇性好，可合成復雜序列多肽；
經濟性好，采用廣泛可用的HPLC設備，降低設備成本，可惠及更多實驗室；
靈活性高，可用于多肽/寡核苷酸的合成，還可以通過更換柱子在合成和純化模式之間切換。
2. 局限性：
對某些復雜序列無法合成；
不同的氨基酸或肽鏈之間的反應速率存在差異，需進一步優(yōu)化；
合成量較小，僅適用于微克至毫克級的合成。
該研究提供了一種簡單、安全且經濟的多肽合成平臺，利用常規(guī)HPLC系統(tǒng)，實現了反應和檢測的同步進行。此方案不僅保持了產物的立體化學完整性，還可以合成具有生物活性的復雜序列片段，有助于推動流動合成技術在更多實驗室中的普及。
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參考文獻：
[1] Romanens, P.; Barluenga, M. D.; Winssinger, N., et al. Peptides on Tap: Automated Flow Synthesis with Standard HPLC [J]. ChemRxiv. 2025.
